Najczęściej zadawane pytania - FAQ
Sekwencjonowanie Sangera
Jak prawidłowo wypełnić formularz zamówienia?
Dla każdej zgłaszanej próby należy wypełnić WSZYSTKIE komórki w wierszu formularza (z wyjątkiem kolumny „Uwagi”, która jest opcjonalna).
Prosimy o upewnienie się, że plik został zapisany po wprowadzeniu zmian!
Niekompletne dane mogą opóźnić lub uniemożliwić realizację zamówienia.
Prosimy o zwrócenie szczególnej uwagi na informację zawartą w nagłówkach poszczególnych kolumn (czerwony trójkąt w prawym górnym rogu komórki).
Który formularz zamówienia mam wybrać?
Nie należy zmieniać struktury wewnętrznej i nazwy formularza, ponieważ uniemożliwi to przesłanie pliku i jego prawidłową interpretację.
- W przypadku kiedy matryca DNA i starter dostarczane są osobno wybierz formularz: TubeSeq (probówki) lub PlateSeq (płytki).
- W przypadku kiedy matryca i starter są już wcześniej wymieszane wybierz formularz: ReadyToSeqTube (probówki) lub ReadyToSeqPlate (płytki).
- Gdy dostarczony jest produkt sekwencjonowania uzyskany w innym laboratorium, gotowy do elektroforezy kapilarnej wybierz formularz:
ReadyToLoadTube (probówki) lub ReadyToLoadPlate (płytki). - Jeżeli matryca przesłana do sekwencjonowania jest bogata w GC, ma stężenie niższe od wymaganego, posiada struktury drugorzędowe lub ma zostać odczytana sekwencja powyżej 700 nt wybierz formularz: ProblemSeq.
- Gdy ma zostać przeprowadzona elektroforeza kapilarna w celu rozróżnienia długości fragmentów znakowanych fluorescencyjnie wybierz formularz:
FragmentAnalysisTube (probówki) lub FragmentAnalysisPlate (płytki).
"Nazwa wyniku" - jak utworzyć?
Nazwę wyniku otrzyma plik zawierający rezultat sekwencjonowania lub rozdziału elektroforetycznego.
Nazwa wyniku musi być UNIKALNA w obrębie jednego zamówienia!
Nazwa może zawierać następujące znaki:
- litery [a-z A-Z (bez polskich znaków)]
- cyfry [0-9]
- podkreślenie, myślnik i kropkę [ _ – . ]
Jaki rodzaj standardu długości DNA oraz filtra do elektroforezy kapilarnej mam wybrać w formularzu zamówienia?
Wybór rodzaju filtra uzależniony jest od użytych barwników fluorescencyjnych, a standardu długości DNA od długości rozdzielanych fragmentów. Przy wyborze kieruj się poniższymi wskazówkami:
- produkty analizy SNaPshot znakowane dR6G, dRROX, dRTAMRA, filtr E5 (DS-02) – standard LIZ120
- fragmenty znakowane FAM, NED, PET, VIC, filtr G5 (DS-33) – standard LIZ120, LIZ600 lub LIZ1200
- fragmenty znakowane FAM, JOE, NED, ROX, filtr F (DS-32) – standard ROX500
Jeśli nadal nie wiesz co wybrać, skontaktuj się z nami: seq@amu.edu.pl.
Jak najlepiej podpisać probówki, stripy i płytki?
Probówki z matrycami najlepiej podpisać kolejnymi liczbami, a probówki ze starterami kolejnymi literami alfabetu.
Nazwy na probówkach muszą być identyczne z wpisanymi w formularzu w pozycjach, odpowiednio, „Nazwa matrycy” i „Nazwa startera”.
Stripy muszą być podpisane na ściankach oraz na wieczkach kolejnymi liczbami (co najmniej pierwsza i ostatnia probówka w każdym stripie musi być podpisana).
Płytkę należy podpisać numerem zamówienia.
Jakie musi być stężenie DNA do sekwencjonowania?
Stężenie i wymagana objętość matrycy DNA do sekwencjonowania:
- Plazmid – Do sekwencjonowania przyjmujemy oczyszczony plazmidowy DNA w stężeniu 90 – 130 ng/µl (min. objętość to 3 µl na jedną reakcję). Jeśli stężenie Twojego preparatu jest niższe zgłoś sekwencjonowanie jako problemowe przy użyciu formularza: ProblemSeq.
- Produkt PCR – Do sekwencjonowania przyjmujemy produkty PCR ze zdjęciem żelu (zdjęcie należy załączyć w polu Dodatkowe informacje przy składaniu zamówienia) (min. objętość to 3 µl na jedną reakcję).
- Jeśli chcesz odczytać sekwencję dłuższą niż 700 pz zgłoś sekwencjonowanie jako problemowe przy użyciu formularza: ProblemSeq.
Jak opisać zdjęcie żelu?
Na zdjęciu żelu muszą znaleźć się informacje dotyczące kolejności prób i nałożonej objętości oraz opis standardu długości DNA.
Jakie musi być stężenie startera do sekwencjonowania?
Startery muszą mieć stężenie 10 μM. Prosimy o dostarczenie startera w objętości 5 µl na reakcję.
Jak przygotować matrycę wymieszaną ze starterem ?
Mieszaninę matrycy i startera przygotuj w objętości 15 µl. W probówce wymieszaj:
- 4,5 µl 10 µM startera,
- odpowiednią ilość matrycy w zależności od rodzaju DNA:
- 450 ng plazmidowego DNA,
- 9 ng DNA/na każde 100 pz oczyszczonego produktu PCR o długości do 500 pz,
- 15 ng DNA/na każde 100 pz oczyszczonego produktu PCR o długości powyżej 500 pz,
- uzupełnij wodą do 15 µl.
Przygotowane reakcje możesz dostarczyć w probówkach 0,2 ml, w stripach lub na płytce.
Probówki 0,2 ml należy podpisać kolejnymi liczbami, płytkę – numerem zamówienia, a na stripach podpisy muszą znajdować się na ściankach oraz wieczkach co najmniej pierwszej i ostatniej probówki.
Do reakcji pobrane zostanie 5 µl. Prosimy jednak o przygotowanie większej objętości na wypadek ewentualnych powtórek.
Startery do sekwencjonowania dostępne w Laboratorium
| M13F-47 | CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC |
|---|---|
| M13R | TCACACAGGAAACAGCTATGAC |
| M13F-21 | TGTAAAACGACGGCCAGT |
| M13R-21 | CAGGAAACAGCTATGACC |
| T3 promoter | ATTAACCCTCACTAAAGGGA |
| T7 universal primer | TAATACGACTCACTATAGGG |
| T7 Terminator | GCTAGTTATTGCTCAGCGG |
| SP6 | TATTTAGGTGACACTATAG |
| ITS1_fun | TCCGTAGGTGAACCTGCGG |
| ITS4_fun | TCCTCCGCTTATTGATATGC |
| ITS5 | GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG |
| EGFP-C | CATGGTCCTGCTGGAGTTCG |
| EGFP-N | CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG |
| pEGFP_CR | CAGGGGGAGGTGTGGGAGGTT |
| umes_F | GGAAGTAAAAGTCGTAACAA |
| umes_R | TCCTCCGCTTATTGATATGC |
| piNDBAC5 | GGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGG |
| piNDBAC3 | CTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGC |
| WPRE_R | CATAGCGTAAAAGGACAACA |
| EF-1a_F | TCAAGCCTCAGACAGTGGTTC |
| DN_new79_R | ACACCCCGAGATTCTGAAACAAACTGGACACACCTC |
| DN_new117_F | CGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAG |
| LucN_R | CCTTATGCAGTTGCTCTCC |
Jak mam sprawdzić, czy moja matryca jest dobrej jakości do sekwencjonowania?
Podstawową metodą oceny jakości matrycy do sekwencjonowania jest elektroforeza w żelu agarozowym w obecności standardu długości DNA. Dotyczy to zarówno plazmidowego DNA jak i produktów PCR po oczyszczeniu na kolumienkach.
Czy mogę zamówić oczyszczanie enzymatyczne produktu PCR przed sekwencjonowaniem?
Tak. Żeby to zrobić w formularzu TubeSeq lub PlateSeq w kolumnie Do oczyszczania wpisz Tak.
Jak zabezpieczyć próby do wysyłki pocztą lub kurierem?
- Do woreczka strunowego włóż probówki lub szczelnie zaklejoną płytkę. Probówek nie należy zabezpieczać parafilmem.
- Dołącz kartkę z nazwiskiem osoby zamawiającej oraz numerem zamówienia.
- Zapakuj worek z próbami do koperty bąbelkowej i wyślij na nasz adres.
- Dokładanie chłodzików nie jest konieczne.
Co oznacza, że sekwencjonowanie jest niestandardowe lub problemowe?
Sekwencjonowanie jest niestandardowe lub problemowe, jeśli:
- stężenie matrycy jest niższe od wymaganego,
- sekwencja jest bogata w GC,
- w sekwencji występują struktury drugorzędowe,
- oczekiwany odczyt ma być dłuższy niż 700 pz.
Czy mogę zgłosić problemową matrycę jako gotową do sekwencjonowania?
Nie. Matrycę i starter należy dostarczyć w osobnych probówkach. Należy wybrać formularz ProblemSeq.
W jakim programie mogę przeanalizować moje wyniki?
- Sequence Scanner (Thermo Fisher Scientific),
- Finch TV (Digital World Biology),
- Chromas Lite (Technelysium).
Konto i płatności
Jak założyć konto?
Jestem studentem/doktorantem, czy mogę założyć konto?
Tak. W formularzu zakładania konta musisz wskazać kierownika projektu (prawdopodobnie promotora), który będzie finansował badania. W przypadku kiedy badania będą finansowane z Twojego grantu, jako kierownika projektu wskazujesz siebie.
Jaki jest czas realizacji zamówienia?
- Czas realizacji zamówienia to 4 dni robocze od momentu złożenia zamówienia i dostarczenia prób do analizy.
- Czas realizacji zamówienia TapeStation w dni robocze to 24h.
- Czas realizacji sekwencjonowania NGS ustalany jest indywidualnie.
Kim jest kierownik projektu?
Kierownik projektu to osoba, która finansuje badania. Może to być promotor, kierownik zakładu, osoba, która zarządza grantem realizowanym na UAM lub osoba w firmie odpowiedzialna za finansowanie badań.
Jak długo wyniki są dostępne na moim koncie?
Wynik są dostępne na koncie klienta przez min. 30 dni.
Jak długo są przechowywane moje próby?
Dostarczone próby przechowywane są w Laboratorium przez 30 dni.
Czy mogę odebrać moje próby?
Tak, przed upływem 30 dni od daty realizacji zamówienia można odebrać próby. Do odebrania prób potrzebny jest numer zamówienia nadany przez Laboratorium.
Co powinienem zrobić jeżeli mam nowe źródło płatności?
Jeśli chcesz realizować kolejny projekt z innym źródłem płatności, prześlij wypełniony formularz z danymi nowego źródła płatności na adres amuseq@amu.edu.pl.
Co mam zrobić jeśli popełnię błąd przy składaniu zamówienia?
Jeśli popełnisz błąd przy składaniu zamówienia, możesz je anulować wysyłając prośbę mailem na adres seq@amu.edu.pl i złożyć nowe poprawne zamówienie.
Czy mogę anulować zamówienie?
Tak, zamówienie można anulować do momentu, aż nie otrzyma statusu „Realizowane”. Wtedy anulowanie jest niemożliwe i zlecający ponosi koszty wykonanych analiz. Żeby anulować zamówienie należy wysłać e-mail na adres seq@amu.edu.pl.
Jakie statusy może mieć moje zamówienie?
Twoje zamówienie może mieć następujące statusy:
- Oczekujące,
- Przyjęte,
- Realizowane – po otrzymaniu tego statusu zamówienie nie może zostać anulowane,
- Wykonane,
- Anulowane.
NGS i TapeStation
Czy mogę zlecić sekwencjonowanie NGS przez wysłanie formularza z mojego konta?
Nie, warunki sekwencjonowania NGS za każdym razem ustalamy indywidualnie. Prosimy o kontakt amungs@amu.edu.pl w celu ustalenia szczegółów.
Jakie kity do analizy na TapeStation są dostępne na bieżąco?
Na bieżąco wykonujemy analizę przy użyciu odczynników i taśm Agilent High Sensitivity D1000. Jeśli chcą Państwo przeprowadzić analizę przy użyciu innych odczynników prosimy o kontakt mailowy amungs@amu.edu.pl.
Jakie musi być stężenie i zakres długości fragmentów DNA do analizy na TapeStation na odczynnikach High Sensitivity D1000?
- Możliwy jest pomiar stężenia DNA w zakresie 10 – 1000 pg/µl
- Zakres długości to 35 – 1000 bp
Jaka jest minimalna objętość próby jaką należy dostarczyć do analizy na TapeStation?
Minimalna objętość próby jaką należy dostarczyć to 5 µl.